本发明公开了一种蒙药塔布森‑2的提取工艺的响应面优化方法,采用Box‑Behnken中心组合试验‑响应面分析法,以塔布森‑2提取液中绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量的综合量值为响应值,优选水提工艺中相关因素的最佳参数值,通过对Design Expert 10.0.7软件拟合多元二次回归模型进行方差分析,确定塔布森‑2最佳水提工艺;本发明还公开了一种蒙药塔布森‑2的质量检测方法;通过建立指纹图谱,为塔布森‑2药材的质量检测提供了可靠的依据;以京尼平苷酸为内参物,通过一测多评方法对塔布森‑2中9个特征组分进行含量检测,结果为该方法可靠,可以代替标准曲线法进行塔布森‑2的含量测定。
1.一种蒙药塔布森-2的质量检测方法,其特征在于, 该蒙药塔布森-2的提取工艺的响应面优化方法,包括以下步骤: (1)原料制备:将药材杜仲、蓝刺头粉碎后过筛,得杜仲粉末和蓝刺头粉末; (2)筛选主效因子的中心水平:以提取时间、提取次数、料液比为变量进行单因素实验,筛选出影响塔布森-2提取液中绿原酸及松脂醇二葡萄糖苷含量的中心水平; (3)响应面优化:根据步骤(2)的实验结果,以料液比、提取次数、提取时间为影响因素,以塔布森-2提取液中绿原酸及松脂醇二葡萄糖苷含量的综合量值为测定指标,按照Box-Behnken响应面进行实验设计; (4)通过Design Expert 软件对步骤(3)的数据进行多元回归分析,建立二次多元回归模型方程; (5)对二次多元回归模型方程进行方差和显著性分析,根据对回归方程失拟的P值检验失拟是否显著,确定二次回归方程是否适当;根据显著性检验,确定回归方程是否显著,根据模型决定系数R2,模型的修正后决定系数Adj R2与模型的预测决定系数Pred R2来确定模型的预测价值; (6)利用Design Expert软件根据二次多元回归模型进行绘图分析自变量和响应值Y的关系,得到回归方程的响应面图,进而得到优化后的水提工艺以使塔布森-2提取液中绿原酸及松脂醇二葡萄糖苷含量最高; 所述步骤(2)中的实验方法为:将步骤(1)中得到的杜仲粉末和蓝刺头粉末,按照重量比1:1混合均匀,置于容器中,控制加水量,浸泡30min后,回流提取,控制提取次数,控制每次的提取时间,过滤,合并药液,得塔布森-2提取液; 所述步骤(3)中各主效因子的水平范围:提取次数为1~4次,提取时间为15~55min,料液比为1:8~1:16; 所述步骤(5)中二次多元回归模型方程为: Y =90.25+2.64A+6.24B-9.91C+2.79AB-0.84AC+4.46BC-15.98A2-13.43B2-10.44C2; 其中,A为料液比,B为提取次数,C为提取时间; 所述步骤(6)中优化后的水提工艺为:将药材杜仲、蓝刺头粉碎后过筛,得杜仲粉末和蓝刺头粉末;将杜仲粉末和蓝刺头粉末,按照重量比1:1混合均匀,置于容器中,加入相当于杜仲粉末和蓝刺头粉末总重的20倍水,浸泡30min后,100℃下回流提取2次,每次30min,过滤,合并药液,得塔布森-2提取液; 蒙药塔布森-2的质量检测方法,包括指纹图谱法和一测多评法,所述指纹图谱法用于构建蒙药塔布森-2的指纹图谱;所述蒙药塔布森-2的指纹图谱中9个特征组分为绿原酸,新绿原酸、京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷,京尼平苷,异绿原酸A、1,5-O-双咖啡酰基奎宁酸,异绿原酸C,紫云英苷;以京尼平苷酸为内参物,一测多评法明确蒙药塔布森-2指纹图谱中9个特征组分位置及含量; 所述构建蒙药塔布森-2的指纹图谱,包括以下步骤: 步骤1:混合对照品溶液的制备:制备含绿原酸,新绿原酸,京尼平苷酸,松脂醇二葡萄糖苷,京尼平苷,异绿原酸A,1,5-O-双咖啡酰基奎宁酸,异绿原酸C,紫云英苷的混合对照品溶液; 步骤2:供试溶液的制备:将不同产地杜仲、蓝刺头药材粉碎,通过40~50目筛,得杜仲和蓝刺头粉末,将杜仲粉末和蓝刺头粉末按照重量比为1:1,置于容器中,加入相当于杜仲粉末和蓝刺头粉末总重的20倍纯水,浸泡30min后,100 ℃下回流提取2次,每次30min,通过180~200目筛网过滤,合并两次药液,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到供试溶液; 步骤3:取经步骤1中制备的混合对照品溶液10μL与步骤2中制备的供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪,进行色谱条件检测分析,并记录混合对照品溶液的指纹图谱和供试品溶液的指纹图谱; 步骤4:将供试品溶液的指纹图谱加载到中药色谱指纹图谱相似度评价软件,经多点校正后进行全谱峰匹配,生成共有模式; 所述一测多评法,包括以下步骤: S01:取上述步骤1中混合对照品溶液1、2、10、25、35、40、50、55 µL进样注入高效液相色谱仪,分别记录不同进样体积时9个特征组分的峰面积,以京尼平苷酸为内参物,计算其余特征组分的相对校正因子RCF和相对保留时间RT; RCF计算公式为ƒs/i=(Ws×Ai)/(Wi×As); 其中,AS为内参物峰面积,Ws为内参物质量,Ai为其余特征组分i峰面积,Wi为其余特征组分i质量; RT计算公式为tR/tR.ref; 其中,tR为当前峰的实际保留时间,tR.ref为对应参比峰的实际保留时间; 其余特征组分分别为新绿原酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、异绿原酸A、1,5-O-双咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、紫云英苷; S02:影响因素考察:以柱温、流速、高效液相色谱仪型号、色谱柱型号为变量进行单因素实验,用于筛选出影响混合对照品溶液中其余特征组分的相对校正因子RCF和相对保留时间RT的因素; S03:方法验证:采用一测多评法和外标法分别对步骤2中供试品溶液的京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、异绿原酸A、1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸C、紫云英苷含量进行测定,通过t检验法分别比较一测多评法的计算值和外标法的实测值; 所述质量检测方法的步骤1中混合对照品溶液的具体制备方法为:分别精密称取绿原酸10.50mg、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、1,5-O-双咖啡酰基奎宁酸、紫云英苷、京尼平苷酸均为10.47mg、京尼平苷10.20mg、松脂醇二葡萄糖苷10.15mg,分别置于10mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度分别为1.050、1.047、1.020、1.015 mg/mL的各对照品储备液;分别吸取上述储备液适量,制备含绿原酸0.66mg/mL,新绿原酸0.22mg/mL,京尼平苷酸0.22mg/mL,松脂醇二葡萄糖苷0.22mg/mL,京尼平苷0.10mg/mL,异绿原酸A0.083mg/mL、1,5-O-双咖啡酰基奎宁酸0.083mg/mL,异绿原酸C 0.022mg/mL,紫云英苷0.039mg/mL的混合对照品溶液; 所述质量检测方法的步骤3和S01中的色谱条件均为:Inertsil ODS-3色谱柱,流动相A为甲醇-流动相B为0.1%磷酸,梯度洗脱,洗脱顺序为:0~5 min,2%→5%A;5~10min,5%→10%A;10~15min,10%→18%A;15~20min,18%→23%A;20~25min,23%→28%A;25~35min,28%→33%A;35~55min,33%→43%A;55~67min,43%→46%A;67~86min,46%→60%A;86~96min,60%→65%A;96~106min,65%→68%A;106~115min,68%→75%A;115~120min,75%→80%A;体积流量:0.6mL/min;检测波长:230nm;柱温:30℃;进样量:10μL。
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