本发明公开了一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT‑PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法以待检测样品的RNA为RNA模板，以牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒三种病毒的遗传特征设计的特异性上游引物和特异性下游引物作为引物，进行RT‑PCR扩增，得到扩增产物，之后将所述扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果，根据电泳检测结果，判断待测样品中是否含有牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒。本发明的有益效果在于：本发明的一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT‑PCR检测方法实现了准确、快速、高效的进行三种病毒性疾病RT‑PCR鉴别和诊断。
1.一种非诊断目的的牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法以待检测样品的RNA为RNA模板，以SEQ ID NO.1所示的牛轮状病毒的遗传特征、SEQ ID NO.2所示的牛冠状病毒的遗传特征、SEQ ID NO.3所示的牛病毒性腹泻病毒的遗传特征，分别设计特异性上游引物和特异性下游引物作为引物，进行RT-PCR扩增，得到扩增产物，之后将所述扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果，根据电泳检测结果，判断待测样品中是否含有牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒； 所述检测方法采用的RT-PCR扩增体系为：25μL的2×FastKing One StepRT-PCRMasterMix，2μL的25×RT-PCR Enzyme Mix，1.25μL的上游特异性引物，1.25μL的下游特异性引物，5.5μL的待测样品RNA模板，加RNase-Free ddH2O至50μL； 所述特异性上游引物为10μM的牛轮状病毒上游引物、牛冠状病毒上游引物、牛病毒性腹泻病毒上游引物三种上游引物组成的混合物，所述特异性下游引物为10μM的牛轮状病毒下游引物、牛冠状病毒下游引物、牛病毒性腹泻病毒下游引物三种下游引物组成的混合物； 且所述牛冠状病毒上游引物序列5′-ATGGCATCCTTAAGTGGGCCGA-3′,所述牛冠状病毒下游引物序列5′-TTACACAGGTAGGGGTTCTATTGCC-3′；所述牛轮状病毒上游引物序列5′-ATGTCTCAGTATTGACGTGACGAGTCT-3′，所述牛轮状病毒下游引物序列5′-CTACAATCGATCAGTTGCATTGCG-3′；所述牛病毒性腹泻上游引物序列5′-ATGGAGTTGATCACAAATGAACTTTTATACA-3′，所述牛病毒性腹泻下游引物序列5′-GCAACTTGTGACCCATAGAGGGC-3′； 所述检测方法采用的RT-PCR扩增条件为：42℃30min，95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，45个循环；70℃5min，4℃保存备用。
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