本发明提供了干酪乳杆菌Zhang的VBNC态的诱导方法以及VBNC态细胞膜脂肪酸的检测方法,属于微生物培养技术领域,所述诱导方法包括以下步骤:将所述干酪乳杆菌Zhang接种于液体MRS培养基中活化后接种到MRS诱导液中于3.5~4.5℃进行VBNC态的诱导,至平板菌落计数法计活细胞数为0,并且荧光显微镜法计活细胞数大于0,获得干酪乳杆菌Zhang的VBNC态。所述方法成功获得VBNC态细胞,丰富了干酪乳杆菌Zhang的VBNC态诱导的诱导液种类。本发明还提供了提取干酪乳杆菌Zhang正常态、VBNC态的膜脂肪酸组分和含量的差异分析结果。
1.干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang的VBNC态的诱导方法,所述干酪乳杆菌Zhang保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC No.1697,其特征在于,由以下步骤组成: 1)将所述干酪乳杆菌Zhang接种于液体MRS培养基中活化获得活化的菌种;所述活化的代数为3代,每一代活化的时间为18~24h;所述活化的温度为37℃; 2)将步骤1)中获得的活化的菌种按体积比1.5~2.5%的接种量接种到诱导液中于4℃进行VBNC态的诱导,至平板菌落计数法计活细胞数为0,并且荧光显微镜法计活细胞数大于0,获得干酪乳杆菌Zhang的VBNC态;所述诱导前,将活化好的菌种于4000rpm×5min离心获得菌泥,用灭菌生理盐水洗涤菌泥2~3次,然后重悬于灭菌生理盐水中,制成乳杆菌菌悬液; 所述步骤2)中诱导的时间为188d; 所述诱导液为液体MRS培养基;所述液体MRS培养基的pH值为6.0~6.8; 所述步骤2)所述接种后,诱导液中干酪乳杆菌Zhang的菌浓度为106CFU/mL; 干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞脂肪酸同时含有肉豆蔻酸、棕棡酸、棕棡油酸、油酸、亚油酸和花生酸组成。
2.权利要求1所述诱导方法获得的干酪乳杆菌Zhang的VBNC态细胞脂肪酸的检测方法,由以下步骤组成: A)离心收集干酪乳杆菌Zhang的正常态和VBNC态细胞的菌泥,分别与甲醇-氯仿溶液混合、振荡10~20min,再加氯仿和超纯水,使得体系中氯仿、甲醇和水的体积比为2:2:1,震荡10~20min,5000g离心10min,取下层氯仿层;所述甲醇-氯仿溶液中甲醇和氯仿的体积比为2:1; B)采用EYELA MG-2200氮吹仪吹收集到的氯仿层25~30min获得浓缩脂肪酸,所用的惰性气体氮气的纯度为99.999%,氮吹仪的加热铝块恒温槽的温度为35~45℃; C)将浓缩的脂肪酸加1mol/L甲醇钠-甲醇进行甲酯化获得脂肪酸甲酯; D)用正己烷萃取脂肪酸甲酯; E)取上层,采用有机过滤器过滤后获得干酪乳杆菌Zhang的正常态和VBNC态细胞膜脂肪酸甲酯化的待测样品; F)用气相色谱检测所述待测样品,检测条件:定制Agilent公司毛细管色谱柱HP88,填充物为(88%-氰丙基)芳基-聚硅氧烷,规格60m×0.25mm i.d×0.25μm film;载气:氮气,纯度为99.999%; 进样口温度:260℃;柱温升温程序:初始温度80℃,保持1min,随后以6.5℃/min速率增至170℃,以2.75℃/min速率增至215℃,并保持2min,以40℃/min速率增至230℃,并保持2min;氢气流量35mL/min、空气流量350mL/min、氮气流量35mL/min;检测器为氢火焰离子检测器(FID),检测器温度260℃;进样量1μL,分流比1:5。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述干酪乳杆菌Zhang的正常态或VBNC态细胞的菌泥与甲醇-氯仿溶液的混合比例为0.5g:1.9mL。
请联系平台
请联系平台